第14章DNAの構造と機能

DNA Sequencing TechniquesDNA配列決定の技術

Until the 1990s, the sequencing of DNA (reading the sequence of DNA) was a relatively expensive and long process. Using radiolabeled nucleotides also compounded the problem through safety concerns. With currently available technology and automated machines, the process is cheaper, safer, and can be completed in a matter of hours. Fred Sanger developed the sequencing method used for the human genome sequencing project, which is widely used today (Figure 14.8).

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1990年代まで、DNAの配列決定（DNAの塩基配列を読み取ること）は、比較的費用も時間もかかる作業だった。放射性標識を付けたヌクレオチドの使用には安全上の懸念もあり、問題はいっそう複雑になった。現在利用できる技術と自動化装置を使えば、この作業はより安価で安全になり、わずか数時間で完了できる。フレッド・サンガーは、ヒトゲノム配列決定プロジェクトで用いられ、今日でも広く使われている配列決定法を開発した（図14.8）。

The sequencing method is known as the dideoxy chain termination method. The method is based on the use of chain terminators, the dideoxynucleotides (ddNTPs). The ddNTPs differ from the deoxynucleotides by the lack of a free 3' OH group on the five-carbon sugar. If a ddNTP is added to a growing DNA strand, the chain cannot be extended any further because the free 3' OH group needed to add another nucleotide is not available. By using a predetermined ratio of deoxynucleotides to dideoxynucleotides, it is possible to generate DNA fragments of different sizes.

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この配列決定法は、ジデオキシ鎖終結法として知られている。この方法は、鎖の伸長を止める物質であるジデオキシヌクレオチド（ddNTP）の使用に基づく。ddNTPは、五炭糖に遊離の3′-OH基がない点でデオキシヌクレオチドと異なる。伸長中のDNA鎖にddNTPが加わると、鎖はそれ以上伸びることができない。次のヌクレオチドを付加するために必要な、遊離の3′-OH基がないからである。デオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドをあらかじめ定めた比率で用いると、さまざまな長さのDNA断片を作ることができる。

Aは、鋳型DNA鎖と、ジデオキシヌクレオチドの存在下で新しく合成された鎖を示す。ジデオキシヌクレオチドが異なる位置で鎖の伸長を止め、さまざまな長さの断片が生じる。各種類のジデオキシヌクレオチドは、異なる色で標識されている。Bは、DNA断片を長さに応じて分離した後の配列読取り結果を示す。断片の色は、その断片の末端にあるヌクレオチドの種類を表す。色を順に読むことで、DNA配列を決定できる。 — Figure 14.8図 14.8
In Frederick Sanger's dideoxy chain termination method, dye-labeled dideoxynucleotides are used to generate DNA fragments that terminate at different points. The DNA is separated by capillary electrophoresis on the basis of size, and from the order of fragments formed, the DNA sequence can be read. The DNA sequence readout is shown on an electropherogram that is generated by a laser scanner.
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フレデリック・サンガーのジデオキシ鎖終結法では、色素で標識したジデオキシヌクレオチドを用いて、それぞれ異なる位置で伸長が止まったDNA断片を作る。DNAをキャピラリー電気泳動によって長さに応じて分離し、できた断片の並びからDNA配列を読み取る。DNA配列の読取り結果は、レーザースキャナーで作成したエレクトロフェログラムに示される。

The DNA sample to be sequenced is denatured (separated into two strands by heating it to high temperatures). The DNA is divided into four tubes in which a primer, DNA polymerase, and all four nucleoside triphosphates (A, T, G, and C) are added. In addition, limited quantities of one of the four dideoxynucleoside triphosphates (ddCTP, ddATP, ddGTP, and ddTTP) are added to each tube respectively. The tubes are labeled as A, T, G, and C according to the ddNTP added. For detection purposes, each of the four dideoxynucleotides carries a different fluorescent label. Chain elongation continues until a fluorescent dideoxy nucleotide is incorporated, after which no further elongation takes place. After the reaction is over, electrophoresis is performed. Even a difference in length of a single base can be detected. The sequence is read from a laser scanner that detects the fluorescent marker of each fragment. For his work on DNA sequencing, Sanger received a Nobel Prize in Chemistry in 1980.

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配列を決定するDNA試料を変性させる（高温に加熱して2本の鎖に分ける）。DNAを4本の試験管に分け、それぞれにプライマー、DNAポリメラーゼ、4種類すべてのヌクレオシド三リン酸（A、T、G、C）を加える。さらに、4種類のジデオキシヌクレオシド三リン酸（ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP）のうち1種類を、各試験管にそれぞれ少量ずつ加える。試験管には、加えたddNTPに応じてA、T、G、Cのラベルを付ける。検出のため、4種類のジデオキシヌクレオチドには、それぞれ異なる蛍光標識が付いている。鎖の伸長は、蛍光標識を付けたジデオキシヌクレオチドが取り込まれるまで続き、その後はそれ以上伸長しない。反応が終わったら電気泳動を行う。長さがわずか1塩基違うだけでも検出できる。各断片の蛍光標識を検出するレーザースキャナーから、配列を読み取る。サンガーはDNA配列決定の研究により、1980年にノーベル化学賞を受賞した。

Gel electrophoresis is a technique used to separate DNA fragments of different sizes. Usually the gel is made of a chemical called agarose (a polysaccharide polymer extracted from seaweed that is high in galactose residues). Agarose powder is added to a buffer and heated. After cooling, the gel solution is poured into a casting tray. Once the gel has solidified, the DNA is loaded on the gel and electric current is applied. The DNA has a net negative charge and moves from the negative electrode toward the positive electrode. The electric current is applied for sufficient time to let the DNA separate according to size; the smallest fragments will be farthest from the well (where the DNA was loaded), and the heavier molecular weight fragments will be closest to the well. Once the DNA is separated, the gel is stained with a DNA-specific dye for viewing it (Figure 14.9).

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ゲル電気泳動は、長さの異なるDNA断片を分離する技術である。通常、ゲルにはアガロースという物質を用いる。これは、海藻から抽出される、ガラクトース残基に富む多糖の高分子である。アガロース粉末を緩衝液に加えて加熱する。冷却後、ゲル溶液を成型トレイに注ぐ。ゲルが固まったら、DNAをゲルに載せて電流を流す。DNAは全体として負の電荷をもち、負極から正極へ向かって移動する。長さに応じてDNAが分離するのに十分な時間、電流を流す。最も小さい断片はウェル（DNAを入れた場所）から最も遠くへ移動し、分子量の大きい断片はウェルの最も近くにとどまる。分離が済んだら、DNAに特異的な色素でゲルを染めて観察する（図14.9）。

最初の写真は、紫外線を照射したアガロースゲル。横に9本のレーンが並ぶ。各レーンには、さまざまな長さのDNA断片を含む試料が入れられており、断片はゲル内を上から下へ移動する間に分離している。DNAは、黒い背景の上に細い白いバンドとして見える。レーン1と9には、DNA標準試料の多数のバンドがある。上部ではバンドの間隔が狭く、下へ行くほど広い。レーン2〜8には、それぞれ1本または2本のバンドがある。同じ長さでゲル中を同じ距離だけ進んだバンドもあれば、長さがわずかに違うため、移動距離が少し異なるバンドもある。2枚目は、DNA試料を入れた8本のピペットを備える手持ち装置を使う人を示す。電気泳動装置内に準備したゲルの真上に、装置のピペットを置いている。ゲルには、それ以前にDNA試料を入れた場所に、すでに数本の試料の線が見える。 — Figure 14.9図 14.9
DNA can be separated on the basis of size using gel electrophoresis. (credit: James Jacob, Tompkins Cortland Community College)
DNAは、ゲル電気泳動を用いて長さに応じて分離できる。（クレジット：James Jacob、トンプキンス・コートランド・コミュニティ・カレッジ）

Neanderthal Genome: How Are We Related?ネアンデルタール人のゲノム：私たちとはどのような関係か

The first draft sequence of the Neanderthal genome was recently published by Richard E. Green et al. in 2010. Richard E. Green et al., “A Draft Sequence of the Neandertal Genome,” Science 328 (2010): 710-22. Neanderthals are the closest ancestors of present-day humans. They were known to have lived in Europe and Western Asia (and now, perhaps, in Northern Africa) before they disappeared from fossil records approximately 30,000 years ago. Green’s team studied almost 40,000-year-old fossil remains that were selected from sites across the world. Extremely sophisticated means of sample preparation and DNA sequencing were employed because of the fragile nature of the bones and heavy microbial contamination. In their study, the scientists were able to sequence some four billion base pairs. The Neanderthal sequence was compared with that of present-day humans from across the world. After comparing the sequences, the researchers found that the Neanderthal genome had 2 to 3 percent greater similarity to people living outside Africa than to people in Africa. While current theories have suggested that all present-day humans can be traced to a small ancestral population in Africa, the data from the Neanderthal genome suggest some interbreeding between Neanderthals and early modern humans.

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ネアンデルタール人のゲノムの最初の概要配列は、最近の2010年にリチャード・E・グリーンらによって公表された。Richard E. Green et al., “A Draft Sequence of the Neandertal Genome,” Science 328 (2010): 710–22。ネアンデルタール人は、現生人類に最も近い祖先である。彼らは、約3万年前に化石記録から姿を消す以前、ヨーロッパと西アジアに住んでいたことが知られている（現在では北アフリカにも住んでいた可能性がある）。グリーンの研究チームは、世界各地の遺跡から選んだ、約4万年前の化石遺物を調べた。骨がもろく、微生物による汚染も激しかったため、試料調製とDNA配列決定には、きわめて精巧な方法が使われた。この研究で、科学者たちは約40億塩基対の配列を決定できた。ネアンデルタール人の配列を、世界各地の現生人類の配列と比較したところ、ネアンデルタール人のゲノムは、アフリカの人々よりもアフリカ以外に住む人々との類似性が2〜3％高いことがわかった。現在の理論では、すべての現生人類はアフリカの小さな祖先集団にさかのぼるとされているが、ネアンデルタール人のゲノムのデータは、ネアンデルタール人と初期の現生人類の間にある程度の交雑があったことを示唆している。

Green and his colleagues also discovered DNA segments among people in Europe and Asia that are more similar to Neanderthal sequences than to other contemporary human sequences. Another interesting observation was that Neanderthals are as closely related to people from Papua New Guinea as to those from China or France. This is surprising because Neanderthal fossil remains have been located only in Europe and West Asia. Most likely, genetic exchange took place between Neanderthals and modern humans as modern humans emerged out of Africa, before the divergence of Europeans, East Asians, and Papua New Guineans.

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グリーンと共同研究者は、ヨーロッパやアジアの人々に、ほかの現生人類の配列よりもネアンデルタール人の配列に似たDNA領域があることも発見した。もう1つの興味深い観察結果は、ネアンデルタール人が、パプアニューギニアの人々とも、中国やフランスの人々と同じ程度に近縁であることだった。ネアンデルタール人の化石遺物はヨーロッパと西アジアでしか見つかっていないため、これは驚くべきことである。最も可能性が高いのは、現生人類がアフリカを出た際、ヨーロッパ人、東アジア人、パプアニューギニア人に分岐する前に、ネアンデルタール人と現生人類の間で遺伝的な交流が起こったという説明である。

Several genes seem to have undergone changes from Neanderthals during the evolution of present-day humans. These genes are involved in cranial structure, metabolism, skin morphology, and cognitive development. One of the genes that is of particular interest is RUNX2, which is different in modern day humans and Neanderthals. This gene is responsible for the prominent frontal bone, bell-shaped rib cage, and dental differences seen in Neanderthals. It is speculated that an evolutionary change in RUNX2 was important in the origin of modern-day humans, and this affected the cranium and the upper body.

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現生人類の進化の過程では、いくつかの遺伝子がネアンデルタール人のものから変化したようである。これらの遺伝子は、頭蓋の構造、代謝、皮膚の形態、認知の発達に関わっている。特に関心を集める遺伝子の1つがRUNX2であり、現生人類とネアンデルタール人とでは異なっている。この遺伝子は、ネアンデルタール人に見られる突出した前頭骨、釣鐘形の胸郭、歯の違いをもたらす。RUNX2の進化的変化が現生人類の起源において重要であり、頭蓋と上半身に影響を及ぼしたと推測されている。